作者：宫绪敏、郑高伟   摄影：宫绪敏

近日，我校生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室及上海生物制造技术协同创新中心许建和课题组，在羰基还原酶的热稳定性和催化活性提高方面研究取得新突破。美国化学会催化杂志ACS Catalysis以“Development of an engineered ketoreductase with simultaneously improved thermostability and activity for making a bulky Atorvastatin precursor”为题报道了这一最新研究成果(DOI: 10.1021/acscatal.8b03382)。

课题组前期研究结果表明，来源于短乳杆菌的羰基还原酶LbCR，在酶促合成阿托伐他汀前体6-氰基-3R,5R-二羟基己酸叔丁酯(ATS-7)中表现出优异的立体选择性，但是在工业应用推广中还存在热稳定性较差和活性不足等瓶颈问题。

研究人员利用突变作用的加和性和协同性同时提高了羰基还原酶LbCR的热稳定性和催化活性。最优突变体LbCR_M8在40°C下的热稳定性是母本的1944倍，催化效率k_cat/K_M是母本的3.2倍。值得注意的是，酶分子改造中经常会遇到稳定性与活性对冲的现象，因此上述热稳定性和活性的同时提升属于非常难得的结果。晶体结构测定表明，突变残基主要位于靠近活性中心的灵活loop环上，热稳定性提高的突变体中引入了新的氢键，并提高了蛋白内部的疏水作用力，从而增强了活性口袋周围灵活loop环的刚性。分子对接结果表明，活性提高的突变点虽然与底物没有直接接触，却导致酶和底物之间氢键作用的增加，从而提高了酶对底物的亲和性，稳定了蛋白与底物结合的作用力。此外，热稳定性提高的突变和活性提高的突变位于两个独立的区域(>10Å)，突变作用的加和性为热稳定性和活性的同时提高提供了可能。最后，使用共表达最优突变体LbCR_M8和BmGDH基因的大肠杆菌细胞作为催化剂，可以在40°C下不对称还原ATS-6生成ATS-7，最终反应成功放大到100 mL，时空产率达到1050 g L⁻¹ d⁻¹，底物/催化剂比率(S/C)达300 g/g。该研究成功实现了阿托伐他汀前体6-氰基-3R,5R-二羟基己酸叔丁酯的规模生物制备。

文章第一作者是华东理工大学在读博士生宫绪敏，通讯作者是郑高伟副教授和许建和教授。该工作得到了国家自然科学基金(Nos. 21536004, 21871085 & 31500592)的支持。