作者：游智能、李春秀     摄影：游智能

近日，我校生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室及上海生物制造技术协同创新中心许建和课题组，在改变羟甾脱氢酶辅酶偏好性方面研究取得新突破。美国化学会催化杂志ACS Catalysis以“Switching cofactor dependence of 7β-Hydroxysteroid dehydrogenase for cost-effective production of ursodeoxycholic acid”为题报道了这一最新研究成果(DOI:10.1021/acscatal.8b03561)。

熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid, UDCA)，化学名为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，是名贵中药熊胆的活性成分，临床上用于治疗胆固醇性结石和胆汁淤积性肝病。目前，熊去氧胆酸主要从熊胆中提取或化学合成。“活熊取胆”是人工养殖黑熊连续不断地抽取熊去氧胆酸的方法，这种方法有违人道且不可持续。化学合成路径繁琐，需经多步羟基保护和去保护步骤，导致总收率低(27%-32%)，并且所用化学试剂(吡啶、CrO₃和肼)会污染环境。

7β-羟基甾醇脱氢酶(7β-HSDH)，是酶法合成熊去氧胆酸的关键酶。该课题组前期从扭链瘤胃球菌ATCC 35915中克隆出一个新的Rt7β-HSDH，随后将其定向进化提升催化性能，最后用于熊去氧胆酸的体外多酶级联合成(Process Biochem., 2015, 50, 598−604;J. Agric. Food Chem. 2017, 65, 1178−1185;ChemBioChem2018, 19, 347–353)。但是，因为需要额外添加昂贵的辅酶NADP⁺，导致生产成本过高，限制了其工业化应用。

本研究提出了一种辅酶特异性反转-小巧突变库的设计策略(CSR-SaSLiD)，理性地设计了一个包含五个突变子的小巧定点突变库，从而快速地筛选到辅酶偏好性反转且活性较高的突变体。相较于母本，Rt7β-HSDH_G39D实现了辅酶偏好性由NADPH到NADH约953,000倍的反转，Rt7β-HSDH_G39D/T17A对NADH的活性提高223倍。随后，研究者利用分子动力学模拟解释了辅酶偏好性反转及活性提高的分子机制，并将CSR-SaSLiD策略应用于另外两个7β-HSDHs的辅酶偏好性反转和活性提升，得到了类似的结果，表明CSR-SaSLiD是一种有效的改造策略。最后，将所得最好的突变体Rt7β-HSDH_G39D/T17A应用于酶法转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸，时空产率达149 g L^-1 d^-1，成本降低了2倍，表明Rt7β-HSDH_G39D/T17A可以用于高效、低成本可持续制备熊去氧胆酸。这将有助于加快熊去氧胆酸的工业化生物合成进程，从而有望彻底解救因“活熊取胆”而遭受悲苦命运的黑熊。

文章的共同第一作者是华东理工大学在读硕士生游智能和陈琦讲师，通讯作者是李春秀副教授和许建和教授。该工作得到了国家重点研发计划(No. SQ2018YFC170017)和国家自然科学基金(Nos. 21536004, 21871085 & 31500592)的支持。